Protocole

liste de matériel

  • navet,
  • boite de pétri,
  • mortier et pilon,
  • balance,
  • bécher 150 mL gradué,
  • éprouvette (au moins) 100 mL,
  • entonnoir,
  • papier filtre,
  • solution tampon  pH 7 
  • pipette de 10 mL + propipette.
  • Matériel ExAO, logiciel AS (atelier scientifique)
  • sonde  O2,
  • Solutions H2O2 : 0,25V,  0,5V, 1V, 4V, 10V, 20V

  • mini seringue,

  • eau distillée.

 

PRINCIPE  de l'expérimentation:
On réalise plusieurs expériences de 2 minutes en utilisant le substrat H2O2 à différentes concentrations.
Chaque expérience s’effectue en 2 temps :

  1. Mesure de la concentration en O2 du milieu contenant l’enzyme sans substrat durant 30 secondes.

  2. Au temps T = 30 s faire l'injection de 0,3 mL de substrat à une certaine concentration et mesurer durant 1 minute 30 s la concentration en O2 du milieu contenant l’enzyme et son substrat.

EXTRACTION DE LA CATALASE DU NAVET :
 

  • Peser 20g de navet émincé dans la boite de pétri,

  • Broyer dans le mortier à l’aide du pilon en ajoutant progressivement 100 mL du tampon PH 7,

  • Filtrer le broyat dans un bécher de 150 mL,

  • Après avoir obtenu 50mL de filtrat (liquide issu de la filtration), verser 25 mL dans l'éprouvette et compléter à 100mL avec le  tampon pH7,

  • Vider le filtrat restant dans la cuvette et rincer le bécher.

  • Verser le contenu de l'éprouvette dans le bécher puis coucher l'éprouvette dans la cuvette (il est important de coucher l'éprouvette pour ne pas risquer de la faire tomber et de la casser pendant la manipulation).


EXPERIMENTATION : détermination de l'évolution de la vitesse initiale

 

  • Introduire 12 mL de filtrat (extrait enzymatique) dans le bioréacteur et fermer celui-ci,

  • Préparer la mini seringue tubulée avec 0,3 mL de substrat (solution de H2O2 à 0.25V) attention sans bulles d'air,

  • Mettre en place la sonde à O2 dans le couvercle du bioréacteur

  • Paramétrer le logiciel en suivant la fiche "réglage du logiciel EXAO" (fiche papier sur la paillasse),

  • Lancer l’agitation à vitesse moyenne,

  • Démarrer  la mesure en cliquant sur "démarrer l’acquisition",

  • Au bout de 30 s, introduire doucement les 0,3 mL de substrat,

  • Laisser se poursuivre l’enregistrement jusqu’à 2 min,

  • Vider le bioréacteur,

  • Rincer le bioréacteur, la sonde et la mini seringue à l’eau distillée,

  • Réitérer l’expérience avec des concentrations en substrat croissantes (0,5V, 1V, 4V, 10V, 20 V)
    Attention, conserver toutes les courbes et les superposer en modifiant la valeur de la concentration du substrat dans le logiciel.