Réaliser une électrophorèse

But recherché :

  • Séparer des molécules (proches d'un point de vue chimique) contenues dans une solution biologique : fragments d'ADN, polypeptides, protéines ... 
  • L'électrophorèse (de électro-, "électricité", et du grec, phorêsis, "transport") est une méthode de séparation basée sur la migration différentielle des molécules protéiques, chargées électriquement, sous l'influence d'un champ électrique. Ces molécules chargées sont séparées par des vitesses de transport différentes qui dépendent de leur charge et de leur poids moléculaire (PM).

Une propriété importante : acides aminés, acides nucléiques et protéines sont des molécules amphotères

  • Les protéines et les acides aminés sont des molécules amphotères c'est-à-dire se chargent  + ou - selon le pH du milieu où elles se trouvent. Exemple ci-contre : l'acide glutamique "glu" ; dans l'acide glutamique les fonctions acide (COOH), amine (NH2) et la fonction acide du radical R (CH2-CH2-COOH).
  • Pour les protéines (ensemble d'acides aminés) l'ionisation est complexe et due aux radicaux (les fonctions NH2 et COOH étant impliquées dans les liaisons peptidiques). Chaque protéine possède un point isoélectrique: le pHi, pH pour lequel la somme des charges de la molécule est nulle. Ce pHi varie (de 1 pour la pepsine à 10 pour les histones) mais un grand nombre de protéines ont un pHi compris entre 4 et 7.

Pour réaliser une électrophorèse de protéines : 
  •  La cuve à électrophorèse est constituée de deux compartiments contenant le tampon véronal à pH=8,6 séparés par une cloison  et un champ électrique est créé par des fils de platine ; C'est sur les languettes (bandelettes) de cellogel posées sur un support  que vont migrer les protéines. Le papier soit être correctement tendu pour que la migration puisse être correcte.
  • déposer le mélange à séparer (sérum ou sang total hémolysé) sur un des côtés de la bandelette (réfléchir sur quel côté il faut déposer la goutte de liquide sachant  sachant que la charge protéique est globalement négative .  Le dépôt doit être propre, ni trop abondant, ni insuffisant : il se fait à l'aide d'un applicateur déposé d'un coup précis et bref au bon emplacement du papier.
  •  brancher l'appareillage (200 V / 7 mA)
  • laisser migrer 1 heure puis colorer les languettes au rouge ponceau pour révéler les taches protéiques.

Critères de réussite :

  1. la bande cellogel est correctement tendue au moment de la pause et plonge des 2 côtés dans le tampon Véronal
  2. les électrodes et les fils électriques de couleur sont correctement reliés
  3. la goutte de liquide déposée à l'aide de l'applicateur est proprement déposée sur la bande de cellogel
  4. la goutte est déposée du bon côté (côté cathode) pour permettre une migration maximale des molécules
  5. le boîtier de la cuve à électrophorèse est correctement fermé et présente toutes les conditions de sécurité requises.
  6. le dispositif d'électrophorèse est laissé sur une table isolée pour éviter toute vibration
  7. la coloration (souvent effectuée par les agents de laboratoires) est proprement réalisée.
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